近日，FDA更新了《人用药物中亚硝胺杂质控制》指南的新版本，为生物医药行业对于亚硝胺杂质研究提供了更明确的指导。随着全球监管机构针对亚硝胺杂质的监管力度持续加强，研发人员需要更加药物安全的风险评估，并从源头上控制其产生。亚硝胺杂质的产生与合成工艺路线密切相关，s36沙龙会云讲堂携手经验丰富的肜祺老师，和您一起解决探索亚硝胺杂质分析的常见问题。

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1 LC-MS仪器分析方法灵敏度是不是很能难达到要求，不能用于亚硝胺基因毒性杂质方法开发？

肜祺：根据实际情况，亚硝胺杂质的检测限度通常非常低，一般在ppm或ppb级别，对于LC-MS来说，这样的灵敏度要求可能超出了它的能力范围。这时可以选择MS-MS联用或高分辨质谱技术来进行研究。

在某些情况下，如果API的日摄入量很低，且亚硝胺杂质的限度能够控制在100 ppm以上ppm水平，LC-MS也有可能被用来检测亚硝胺杂质。

2 如果没有亚硝胺标品的情况下如何进行研究？

肜祺： 在LC-MS或GC-MS方法开发过程中，针对不同亚硝胺化合物，其吸收和响应特性是存在差异的。因此，为了确保分析的准确性和重现性，开发专属的检测方法是非常必要的。这通常需要亚硝胺的标准品来进行方法的建立和验证。

然而，在研究过程中，如果亚硝胺的标准品难以获得，或者通过多种尝试仍无法得到稳定的标准品，这可能从侧面反映出在正常条件下，API中亚硝酸类杂质的存在概率较低。在这种情况下，可以在资料中进行详细的描述和论证，说明由于亚硝胺标准品难以获得，从而推断其产生的风险较低。在这个情况下，可以不必进行深入的方法开发。

3 IND阶段就要完成亚硝胺杂质研究吗？

肜祺：在IND阶段，对于基毒杂质的研究，尤其是亚硝胺这类突变杂质，现在大家的要求越来越严格和完善。对于非癌症治疗药物，评审老师通常会要求在IND阶段就开始对突变杂质进行初步研究。亚硝胺杂质由于其潜在的致癌风险，属于ICH M7(R2)指南中提到的“关注队列”物质。因此，在IND阶段进行初步评估是非常必要的。
后续在NDA阶段，由于工艺可能会有所调整，因此IND阶段对于突变杂质的评估可能不需要过于深入，进行初步的评估和控制就可以。

4 亚硝胺杂质方法开发有没有推荐的色谱柱?

肜祺：根据一般项目情况，我们通常使用标准的十八碳色谱柱来检测亚硝胺等化合物，这些色谱柱能够高效地分离并检测目标化合物。也需要根据具体项目的化合物的特性和分离需求，选择最合适的色谱柱，确保分析结果的准确性和可靠性。

5 如果多批样品中检测出10%限度以上的亚硝胺杂质，质量标准中亚硝胺限度是否可以按计算出的单个亚硝胺限度进行制订？

肜祺：若仅有1个亚硝胺杂质检出为10%限度以上，则可按计算出的单个亚硝胺限度设定质量标准；若多个亚硝胺杂质均为10%为了不超过ICH M7(R2)指南中概述的1:10万的可接受风险水平，有两种方法被认为是可接受的:
1. 所有确定的n -亚硝胺的每日总摄入量不超过确定的最敏感的n -亚硝胺的限度；
2. 所有确定的n -亚硝胺计算的总风险水平不超过十万分之一；
2.1 固定方法：对单个亚硝胺设定固定的限度，不需要对总n -亚硝胺设定限制。每种n-亚硝胺的限量应按其限度的百分比设定，使每种指定亚硝胺的限度百分比总和不超过100%；
2.2 灵活方法：每种n-亚硝胺按计算出的限度设定标准，并要求对总n-亚硝胺规定额外的限量为每种指定亚硝胺的限度百分比总和不超过100%。详见EMA亚硝胺问答Q10。

6 使用EP或USP的原检测方法，方法是否可以不用验证？

肜祺：使用EP、USP的原检测方法，需要进行方法确认，确认检测实验室可满足灵敏度、线性、准确度等的需求，以确保检测结果的可靠性。

7 什么情况下需要做加强AMES试验？

肜祺：若不能在权威机构数据库中检索到已识别出的n-亚硝胺杂质的毒理数据，可用加强AMES试验、体内致突变试验等确证该n-亚硝胺杂质的活性；尤其是在样品中该亚硝胺杂质检出量超出根据常规方式（如致癌效力）计算出的限度时可以进行。
但是对于亚硝胺杂质检出量超出根据常规方式计算出的限度时，首先需要确认其来源，尽量从源头进行去除，采取避免为主，控制为辅的控制策略。

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